Allgemeine Eigenschaften
Lipide lassen sich mit unpolaren Lösungsmitteln, nicht aber mit Wasser, extrahieren. Die Polarität eines Lösungsmittels ist im wesentlichen proportional dem Dipolmoment und der Dielektrizitätskonstante
(= Mittel aller beteiligten Dipolmomente).
Trennung eines Lipidextraktes von Kalbsleber durch Dünnschicht-Chromatographie
Das organische Extrakt der Kalbsleber enthält Membranlipide (Phospholipide, Sphingo-myelin, Glycolipide und unverestertes Cholesterol) und Triglyzeride, welche in der Leber bei Leberverfettung
vermehrt zu finden sind. Die Phospholipide unterscheiden sich von den Triglyceriden dadurch, dass nur zwei der Hydroxylgruppen des Glycerins mit Fettsäuren verestert sind, während die dritte
Phosphorsäure enthält. Diese sogenannten Phosphatidsäuren sind meist am Phosphatrest weiter substituiert mit Verbindungen wie Cholin, Ethanolamin, Serin oder Inositol.
Prinzip der Auftrennung:
Lipidmischungen können sowohl analytisch wie auch präparativ in ihre einzelnen Komponenten aufgetrennt werden, z.B. durch Ionenaustausch-Chromatographie oder Adsorptions-Verteilungschromatographie.
Die Dünnschicht-Chromatographie ist dabei eine der einfachsten und schnellsten Techniken zur Trennung von Lipiden.
Die verwendeten Dünnschichtplatten sind mit Kieselgel beschichtet (stationäre Phase), während das Laufmittel (mobilie Phase) aus einer Mischung von organischen Lösungsmitteln
besteht. Somit ist die stationäre Phase polar (hydrophil), die mobile Phase dagegen apolar (hydrophob).
Die Auftrennung der Phospholipide erfolgt auf Grund ihrer amphiphilen Eigenschaften nach Polarität (stationäre Phase) sowie ihrer Löslichkeit in den unterschiedlichen Lösungsmitteln.
Identifizierung der Lipide:
Die Identifizierung der aufgetrennten Lipide erfolgt auf Grund verschiedener Anfärbungs-methoden. Die Ammoniummolybdat-Färbung (blau) färbt die meisten Lipide an, das Ninhydrin-Reagens
(blauviolett) ist spezifisch für Lipide mit einer freien Aminogruppe, d.h. für Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylserin.
Vorgehen:
Es wird eine eindimensionale Auftrennung parallel zu den 6 Standartlösungen sowie eine zweidimensionale Auftrennung des Leberextrakts durchgeführt.
Dosierung von Lipiden und Lipoproteinen im Serum
Hyperlipidämie und Arteriosklerose
Eine Hyperlipidämie ist eine pathologische Erhöhung der Lipidkonzentration im Blut – gebunden an Lipoproteine.
Eine Arteriosklerose ist eine pathologische Verhärtung eines Blutgefässes, Organs oder Gewebes. Dabei wird übermässig Bindegewebe abgelagert, wobei das organspezifische Gewebe
mehr und mehr verschwindet.
Unter normalen Bedingungen zirkulieren die Lipide zwischen Blut und Lymphe. Ein Teil der Lipoproteine wird durch Endozytose aufgenommen und ihre Lipide (mit Ausnahme von Cholesterol) zur Energiegewinnung
abgebaut.
Bei Arteriosklerose kommt es zur Zellyse von Monozyten, wodurch ihre übermässig gespeicherten Lipide (Hyperlipidämie!) freigesetzt werden und eine Entzündung bewirken. Das entzündete
Gewebe wird durch sklerosierendes Bindegewebe ersetzt. Dadurch wird das Lumen der sklerosierten Gefässe (hauptsächlich Intima und Media) verkleinert und die Durchblutung der betroffenen
Gewebe nimmt ab (Gefahr für Herzinfarkt!).
Klassifizierung der Lipide und Lipoproteine
Im Blut werden Lipide, gebunden an Lipoproteine, transportiert – mit Ausnahme von freien Fettsäuren, die mit Albumin assoziieren.
Um Lipoproteine zu klassifizieren, werden heute mehrere Methoden verwendet: Elektrophorese, Ultrazentrifugation oder Fällung durch Antikörper.
Elektrophorese:
Chylomikronen - wandern nicht!
b-Lipoproteine (LDL) - b1-Globuline
Prä-b-Lipoproteine (VLDL) - a2-Globuline
a-Lipoproteine (HDL) - a1-Fraktion
Bemerkung: Chylomikronen treten physiologischer Weise nur nach einer Mahlzeit im Blut auf (Lipid-Absorption!)
Ultrazentrifugation:
Durch die Lipide sind Lipoproteine schwerer als normale Proteine. Die Dichte der Lipoproteine variiert mit der Lipid / Protein Fraktion. Je mehr Lipide ein Lipoprotein enthält, umso schwerer
ist es.
Lipidverteilung:
Chylomikonen - Triacylglyceride (Darm › Peripherie)
VLDL - Triacylglyceride (Leber › Peripherie)
LDL - Cholesterin (Leber › Peripherie)
HDL - Cholesterin (Peripherie › Leber)
- Phosphoglyceride
Blutuntersuchung:
Das Blut muss in nüchternem Zustand entnommen werden. Es wird nach folgenden Kriterien untersucht:
- Aussehen
- Lipidkonzentration
- Lipoproteinanalyse
- Apolipoproteinanalyse
Aussehen: Der Grad der Trübung ist ein Indiz für die vorhandene Menge an Triacylglyceriden.
Lipidkonzentration: In der Klinik werden hauptsächlich die Triacylglycerin- und
Cholesterinkonzentration gemessen.
Lipoproteinanalyse: Nur eine Erhöhung der LDL- und VLDL-Konzentration führt zu Arteriosklerose, während eine Erhöhung der HDL-Konzentration eher einen Schutzeffekt
besitzt (Rücktransport
des Cholesterins zur Leber!).
Die Lipoproteinanalyse wird gewöhnlich durch Elektrophorese oder Fällung durchgeführt, da die Ultrazentrifugation sehr teuer ist.
Cholesteroldosierung
Prinzip der Messung:
Will man die Gesamt-Cholesterol-Konzentration messen, müssen zuerst die vorhandenen Cholesterolester-Bindungen durch die Cholesterolesterase gespalten werden. Dabei entsteht ein freies Cholesterol
und eine freie Fettsäure. In Gegenwart von Sauerstoff wird das Cholesterol durch eine Cholesterol-Oxidase oxidiert, wobei Cholestenon und H2O2 entsteht. Die Reduktion von H2O2 zu H2O durch die
Peroxidase ist gekoppelt an die oxidative Bildung eines Farbstoffs (Komplexbildung), dessen Konzentration photometrisch gemessen werden kann.
PAP-Methode: Peroxidase-4-Amino-Phenazon (roter Quinon-Imin-Komplex)
Farbstoff entsteht aus 4-Amino-Phenazone und 3,4-Dichlorophenol.
Normalwerte: erhöhte Cholesterinwerte ab 6,7 mmol (Gesamt-Cholesterol) freies Cholesterol: 20-40% des Gesamt-Cholesterols
Bermerkungen: Zur Bestimmung der freien Cholesterol-Konzentration wird der gleiche Ablauf verfolgt, nur das keine Cholesterolesterase der Reaktion beigegeben wird.
Achtung: Das Blut muss hämolysefrei sein, da Hämoglobin die Messung verfälscht!
HDL-Cholesterol Messung
Prinzip der Messung:
Durch Zugabe einer speziellen Lösung können alle Lipoproteine mit Ausnahme der HDL ausgefällt werden. Das Prinzip der Fällung ist das „Salting-out“, durch welches grosse
Proteine bereits bei kleinen Salzkonzentrationen, kleine Proteine aber erst bei grossen Salzkonzentrationen ausfallen. In diesem Fall wird die Salzkonzentration so gewählt, dass nur die VLDL und
die LDL ausfallen, die HDL dagegen in Lösung bleiben, da sie die kleinsten Lipoproteine sind.
Daraufhin kann die Cholesterol-Konzentration der HDL durch die vorgängig beschribene Messmethode bestimmt werden.
Bemerkungen:
- Achtung: Mit dieser Messmethde wird auch das freie Cholesterol mitgemessen!
- Normalwerte:
Mann 1 – 1.4 mmol HDL-Cholesterol / Liter
Frau 1.2 – 1.7 mmol HDL-Cholesterol / Liter
Triglycerid Messung
Prinzip der Messung:
Die Triacylgylceride werden enzymatisch hydrolysiert. Das dabei frei werdende Glycerol wird anschliessend photometrisch mit der PAP-Methode gemessen.
Triglyceride + 3 H2O › Glycerol + 3 Fettsäuren (Lipase)
Glycerol + ATP › Glycerol-3-Phosphat + ADP (Glycerolkinase)
Glycerol-3-Phosphat + O2 › Dihydroxyaceton-Phosphat + H2O2 (Glycerol-3-Phosphat-Oxidase)
H2O2 + 3,4-Dichlorophenol + 4-Amino-Phenazon › (Peroxidase)
2 H2O + Quinon-Imin-Komplex (photometrisch messbar!)
Bemerkungen:
- Normalwerte: erhöhte Triglyceridwerte ab 2.3 mmol / Liter
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